- ELISA (文責宮内）
- コーティング：抗原をプレートに結合させる
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※抗原の濃度：10μg /μl － 100μg /μl in PBSもしくはNa2HCO3
（通常は20μg /ml、短時間で行いたい場合には40μg /ml）
抗原を新しいエライザプレートに50μl/wellずつ入れる。
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4℃ で数時間（40μg / μlの場合）もしくはオーバーナイト（20μg / ml）
- 抗原を捨てて、イオン交換水で２回washする。その後水気を取り除くため
キムタオルに軽くたたきつける（両面とも）。
- 抗体が抗原に非特異的に結合するのを防止するためにブロッキングを行う。
→（－）serum blocking sol. を100μl / wellずつ入れ、室温で３０分置く。
- blocking sol.を捨てて、一次抗体を50μl / wellずつ入れ、室温で1 hr － 1.5 hr置く。
Wash →イオン交換水で５回washする。wash後以前のwash時と同様にキムタオルで水気をとる。
- 次抗体を一次抗体に結合させる。二次抗体は50μl / well入れ、室温で1 hr － 1.5 hr置く。
- 二次抗体を希釈する際はblocking sol.で希釈すること。
（さもないと非特異的に結合して真っ黄色になります）
※ 二次抗体anti-mouse IgG － HRPの場合、3000倍に希釈する。
- 結合していない二次抗体を洗い流す。
→ イオン交換水４回・PBS２回・イオン交換水２回
wash後以前のwash時と同様にキムタオルで水気をとる。
- 反応液を100μl/wellずつ入れ、室温で３０分程度反応させる。
→ 反応液：0.1 Mクエン酸pH4.5 (NaOHで適定) 10ml / plate
オルトフェニルジアミン（OPD）ミニスパーテル１杯/10ml
過酸化水素水（H2O2） 1/2000 vol.
- 反応を止める。
→0.5 M硫酸を100μl / well入れる。※硫酸なので気をつけること。
- 反応後、吸光度（490 nm）で測定
- アルミホイルで遮光し室温で保存。
※ wash時のPBSはTBSでも可。